由于新冠疫情的爆发并在全球席卷扩散,“核酸检测”一词在人们的日常生活中早已不再陌生。当拿到核酸报告后,人们首先关注的便是检测结果,阴性还是阳性,然而检测人员是如何发现病毒这个可恶的家伙,阴性或者阳性是依据什么标准来判断?血清抗体检测也可以用来检测是否存在新冠病毒,IgM、IgG抗体具有一定临床意义。
核酸就是我们常说的遗传物质,核酸的基本组成单位是核苷酸,包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两种,由于核苷酸排列顺序的千变万化,故核酸具有显著特异性。新冠病毒核酸为单正链RNA,包含29903个碱基,编码约9860个氨基酸,主要有五个必需基因,分别编码核蛋白(N)、病毒包膜蛋白(E)、基质蛋白(M)和刺突蛋白(S)4种结构蛋白及RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp),市面上的新冠病毒核酸检测试剂盒试剂应至少包含针对新冠病毒开放读码框1ab(openreadingframe1ab,ORF1ab)和核壳蛋白(nucleocapsidprotein,N)基因区域的检测。
核酸检测,通常使用实时荧光RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)检测新冠病毒的RNA, 当然在使用这项技术之前需要对病毒核苷酸(碱基)的组成进行测定和排序,这就是我们所说的基因测序,来获得新冠病毒的基因序列,这是一种更为精确的基因检测技术,但由于基因测序所需的时间较长约为24-72h,时间、人力、资源等成本太高,一般不作为大面积筛查使用。
RT-PCR检测核酸仅需2-4小时就可以出结果,那么这究竟是如何做到的呢?首先需要根据基因测序结果设计病毒的特异性引物,即复制的模板,由于新冠病毒的RNA不稳定,需要将RNA逆转录为更加稳定的cDNA进行检测。新冠病毒的核酸分子量小,需要经过将其不断的复制至仪器可以检测到的量,那么这个复制的次数就为阈值( cycle threshold value,CT值),这个可以检测到的量称为阈值,即最小可检出量,当病毒基因的荧光信号超过阈值时PCR循环的次数即为CT值,使阈值线位于扩增曲线指数期,阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线时,仪器上目标基因呈现S型扩增曲线,即判断为阳性,反之则为阴性。
CT值多少时算阳性,当病毒毒力足够大具有传染性时认为是阳性。例如CT值取35时,那么低于这个值判断为阳性,反之为阴性。CT值与模板的起始拷贝数的对数呈一定线性关系,起始模板量浓度越高,那么达到一定值所需的循环次数就越少,反之浓度越低所需的循环次数就越多。那么我们就知道当标本的病毒含量越高时,CT值越小,反之病毒含量越低时CT值越高。一言以蔽之,CT值越高,样本原始病毒载量越低,反之同理。
CT值受到样本、实验室环境以及仪器等各种条件的影响,因此CT值并不是恒定不变的,即使相同情况对标本进行二次检测,CT值也不会完全一致。
CT值取值是人为确定的,如图当我们手动调整基线(baseline)时,CT值也会随之变化,每次实验由于样品和仪器的不同会导致基线的改变,进而影响CT值。因此,在判断结果时要综合判断,尤其是在临界值附近。
美国、日本等许多国家,通常将CT值标准设置在40,也就是循环40次以后能侦测到,便视为阳性;哈佛大学的 Michael Mina 大力主张改变 CT 值的标准,认为当病毒需要复制40次才能被检测到时,此时的病毒毒力太弱,不具备感染力。
说了这么多关于CT值在检测中的意义,但是在新冠检测报告单上我们只能看到阴性或者阳性结果,一般不会对CT值进行披露,这是因为报告CT值有许多局限性,定量检测的验证更为复杂,需要更严格的测试来确保性能,因此不鼓励使用CT值来指导患者管理。生物差异、样品充足性、接触时间、仪器、方法学、认证参考物质的缺乏以及监管因素等诸多因素都会影响新冠病毒定性检测中检测到的CT值。因此,不鼓励报告或披露CT值以指导患者管理。
IgM:阳性代表新冠感染者处于感染初期,大约在感染1~2周出现,第3周左右其浓度会随着清除病毒的作用逐渐递减。
IgG:阳性代表新冠感染者处于感染未期或恢复期,感染后期人体会产生IgG,且会在人体内停留数月之久。当病毒二次侵入时,IgG立刻发挥作用,将病毒标定,由人体的白细胞将病毒清除。 有些人打完疫苗后身体会产生IgG,这当然是好事,说明疫苗发挥了保护作用。当新冠再次入侵时,身体会启动免疫反应清除病毒。这就是为什么呼吁广大民众积极按程序接种新冠疫苗的原因了。
当前,国内外疫情仍较为复杂多变,动态清理策略是目前保障全民健康最有效的措施,这场持续了2年的疫情让大家熟知了PCR、CT值、IgG和IgM等生物医学专业词汇,核酸检测已深入千家万户,希望这场疫情给大家带来的不仅仅是知识的更新,更是接受了一场公共卫生素养的提升教育。疫情防控不容松懈,采样、提取、加祥、上机及结果的分析录入,每一步都需要认真对待,实验人员应当综合考虑各种可能出现的状况,以给大家出一份专业的报告。